自2009年荷兰科学家Hans Clevers团队成功将Lgr5+肠道干细胞在体外培养成具有三维结构的小肠类器官模型之后，类器官的研究进入新时代，相关文章如雨后春笋一般，不断涌现。

仅过去的2023年上半年，“Organoid”相关文章就有2194篇，远超前几年同期水平，意味着该领域的研究热度还在升温。

那么作为当前全国乃至全球生命科学及医学研究领域最受关注的热点之一，类器官究竟是何方神圣？又有哪些神通？今天就与大家一起梳理一下。

一、 类器官的概念

类器官是指在体外三维（3D）环境中培养生长的微型细胞簇，这些细胞簇在细胞因子、化学小分子抑制剂/激活剂、培养基及其他添加剂等物质作用下，经过自组织并分化为功能性细胞群，具有类似相应器官的组织结构和遗传学特点。

类器官不是真正意义上的器官，但是它能够最大程度上模拟体内器官的结构和功能，并且能长期稳定传代培养，因此也被称为“微型器官”。

二、 类器官的发展史

在过去的100年里，二维(2D)细胞系和动物模型已经成功地应用于生物医学领域，可用于提高对细胞信号通路的认识，制定候选化合物设计指南，识别潜在的药物靶点，并阐明疾病的潜在病理机制。在当今世界生物医学研究中，这些系统的广泛使用是模型系统的价值体现。

然而，2D细胞系因其缺乏层次结构、维度、细胞多样性和细胞-细胞或细胞-基质相互作用，导致难以模拟组织中存在的细胞功能。动物模型因动物与人类之间的物种差异而不利于药物发现。组织外植体，虽可短暂地捕获生理相关的细胞组织和相互作用，但由于表型的快速消失，而很难在体外长时间维持。再者，了解人类遗传多样性，了解其对疾病病原和药物反应的影响，对于实现个性化医疗至关重要。因此，需要优化模型系统，以更好地模拟体内环境。

人类多能干细胞(human pluripotent stem cell，PSC) 技术和成体干细胞 (adult stem cell ，AdSC；也称为组织干细胞) 培养系统的出现为建立体外人类特异性模型以用于研究与人类疾病相关的遗传变异以及在大规模化合物筛选中生成细胞材料开辟了道路。

1998年，人类胚胎干细胞(ESCs)系建立，是第一个人类多能干细胞系。

2006年，通过插入编码基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的转录因子，对小鼠成纤维细胞进行了重新编程，使其成为PSCs。这些细胞在基因表达和发育成三胚层的潜力方面与ESCs相似，被称为诱导PSCs (iPSCs)。

2007年，首次建立人类iPSCs (hiPSCs)技术，并广泛用于生成人类“disease-in-a-dish”模型。这项技术可以实现个性化的疾病建模，这将成为精准医学的重要组成部分。

随后，CRISPR/Cas9技术使得基于基因编辑的hiPSC疾病模型的创建成为可能。

早期的方法侧重于iPSC衍生的2D细胞培养，这种培养通常缺乏细胞间的相互作用、多样性和微回路。近年来，体外人体三维（3D）器官培养方法的出现受到了广泛的关注，因为其可同时对更复杂的器官样结构和不同的细胞类型进行建模。

来源于原代组织的3D类器官，ESCs或iPSCs可以自我更新和自我组织，并表现出与体内器官相似的多细胞性和功能。

1946年，“类器官”在肿瘤学中首次作为“畸胎瘤”的同义词被报道。在1960s代，“类器官”被用来描述发育生物学家进行的细胞分离和重新聚集实验中的器官发生。先前的研究利用了原代组织的3D自组织能力。

2009年，建立的肠道类器官培养系统引发了干细胞领域类器官系统的改进。该系统可以通过提供体内肠干细胞生态位成分（包括表皮生长因子EGF、Noggin和R-spondin-1）来维持分选Lgr5+干细胞或解剖隐窝的上皮样细胞的长期培养，并嵌入基质胶中以促进扩张，这些类器官在很大程度上复制了体内的组织结构，并含有相对完整的干细胞、祖细胞和终末分化细胞类型。通过修改生长因子和细胞分离程序的组合，研究人员可以快速改变3D培养系统，以生成多种人类正常和癌性类器官，如大脑、结肠、胃、和肝脏类器官。这种肠类器官体系的成功建立开启了类器官研究的新篇章，迅速成为新的研究热点。

随后，科学家们从小鼠和人的组织中培育出多种类器官。

从多能干细胞（PSC）衍生的不同类器官的示意图

胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）被探索用于研究用途。通过引入四种转录因子，体细胞（Somatic cells）可以被重新编程为iPSC。随着发育的进行，囊胚分化为胚胎干细胞，并进一步形成所有三个胚层：内胚层、中胚层和外胚层。胚胎内胚层（endoderm）随后产生胃肠系统、心脏、肺和肝脏。中胚层（mesoderm）发育成肾脏和血管系统，而外胚层（ectoderm）形成神经外胚层，最终形成具有不同区域的大脑，包括海马（hippocampus）、视杯（optic cup）、小脑（cerebellum）等。

从器官中衍生出类器官，描述干细胞（stem cell，SC）衍生的类器官

这些类器官可以从器官中产生。与胚胎干细胞（ESC）不同，成体干细胞（AdSCs）是位于成人器官中的未分化细胞，如肺、脑、肝、肠和肾。用适当的培养条件处理后，AdSC能够在体外形成类器官。

类器官研究发展史（PMID: 32459504）三、 类器官的3D培养系统

3D细胞培养系统是类器官产生的基础，它通过悬浮培养建立，使用支架或无支架技术以避免细胞与塑料盘的直接物理接触。

其中，支架是类似于天然ECM的生物凝胶或合成水凝胶，最常用的Matrigel，是由Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤细胞分泌的异质凝胶状蛋白质混合物，它主要包含粘附蛋白，如胶原蛋白、巢蛋白、层粘连蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖，类似于细胞外环境，能够为细胞提供结构支持和ECM信号。

无支架技术则是细胞在重力和表面张力作用下悬挂在平板上的特定培养基液滴中培养的技术。此外，类器官的3D结构也可以通过“气液界面”建立，在这种情况下，细胞在最初浸没在培养基中的成纤维细胞或基质胶基底层上培养，培养基逐渐蒸发并将上层细胞层暴露在空气中以允许极化和分化[1]。

相较于传统2D细胞培养或者昆虫以及哺乳动物等模型，类器官模型在各方面都给予了更大的想象空间。

类器官模型的优势（参考PMID: 32636524）四、 类器官的培养

类器官可来源于胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）、成体干细胞（ASC），或者肿瘤组织。

对于ESC/iPSC衍生的类器官，ESC/iPSC在各种细胞生长因子或小分子化合物（抑制剂/激活剂）以及基质胶和细胞培养添加剂的逐步分化方案下，能够按照类似于原肠胚形成和器官发生过程中的发育线索，从三个胚层生成类器官。

对于ASC来源的类器官，ASC需要从胎儿或成人组织中产生；获得单个ASC或含有ASC的组织单元之后，再通过3D培养方案形成类器官。

对于肿瘤组织来源的类器官，肿瘤组织内含有小部分具有干细胞活性的肿瘤细胞，通过将肿瘤来源的组织细胞或者分离出的肿瘤干细胞等进行3D培养，能够衍生出肿瘤类器官（Tumoroids）。

以胃肠道类器官培养为例：

胃肠道类器官的培养（PMID: 35636923）IBD：炎症性肠病；CRC：结直肠癌

胃肠道类器官可以来自于ASCs（上图左）：先从结肠镜检查、胃镜检查或手术期间收集的胃肠道活检中分离出组织驻留干细胞，在乙二胺四乙酸（EDTA）或酶消化后，单个细胞或组织碎片（隐窝结构或导管碎片）被嵌入ECM中，并用添加了不同有丝分裂原、成形素和细胞因子的组合培养基覆盖，以诱导细胞自我更新和组织分化。

胃肠道类器官也可以来源于ESCs和iPSCs（上图右）：首先，使用Activin A诱导ESCs/iPSCs向内胚层定向分化；随后再根据目标类器官需求向前肠/中肠/后肠内胚层分化；其中，前肠主要分化为胃、肝、胆或胰腺等类器官；中肠/后肠主要分化为肠道类器官，最后，这些前体球状体可以根据不同的生长因子方案进一步进行终末分化，定向分化形成特定的组织和器官。

脑类器官

中枢神经系统来源于神经外胚层。在没有神经分化抑制剂（如BMP、Nodal和 Wnts）的情况下，胚胎干细胞（ESCs）培养中会发生自发神经分化，这与ESCs的神经默认状态一致。

在该培养系统中，从无生长因子的二维培养物中分离出的ESCs在96孔非粘附培养板中重新聚集，重新聚集体在不含或含有最少生长因子的无血清培养基中保存7天，之后将它们重新接种在粘附板中。当管腔形成时，ES细胞分化并极化形成连续的神经外胚层样上皮细胞，随后产生分层皮质组织，其中包含皮质祖细胞、深皮质层神经元、浅皮质层神经元和所谓的Cajal-Retzius细胞。在没有生长因子的情况下，生成的皮层组织自发地向延髓下丘脑发展。区域特征（例如，嗅球、头侧和尾侧皮质、下摆和脉络丛）可以通过添加特定的细胞因子（如Fgf、Wnt和BMP）进行选择性控制[2]。

胃类器官

胃从后前肠发育而来。Wells及其同事使用激活素处理人类PSC以生成定形内胚层。随后添加BMP抑制剂、FGF和Wnt激活剂诱导细胞向前肠发展。当使用视黄酸时，类器官向后前肠发展。最后，高浓度的EGF将它们转化为人类胃类器官，经历类似于小鼠胃窦发育的分子和形态发生阶段。类器官包含原始胃腺体和凹陷样结构域、具有Lgr5+干细胞的增殖区、粘液细胞和大量胃内分泌细胞[3]。

肺类器官

肺起源于发育中的腹侧前肠内胚层中的Nkx2-1+祖细胞。一项初步研究证明了原始肺和甲状腺祖细胞与胚胎干细胞的定向分化。Snoeck及其同事设计了一个改进的四阶段50天方案：首先，Activin A诱导定形内胚层；随后，通过连续抑制BMP、TGF-β和Wnt信号传导诱导前部前肠内胚层；然后通过Wnt、BMP、FGF和RA将细胞腹侧化以获得肺和气道祖细胞；最后，使用 Wnt、FGF、c-AMP和糖皮质激素使上皮细胞类型（基底细胞、杯状细胞、Clara 细胞、纤毛细胞、I 型和 II 型肺泡上皮细胞）成熟[4]。斯宾塞和他的同事们同样从 Activin A处理的人类PSC开始，随后添加TGFβ/BMP抑制剂、FGF4和Wnt激活剂指示细胞朝向前部前肠发育[5]。当Hedgehog通路同时被激活时，类器官在腹侧向肺发育。在嵌入Matrigel并长时间暴露于Fgf10后，出现了成熟的肺类器官。培养物可以维持几个月，类似于近端气道，含有基底细胞、纤毛细胞和Clara细胞。内胚层气道组织通常被平滑肌肌动蛋白 (SMA) 阳性间充质细胞包围。远端（肺泡）气道的早期标记在培养早期表达，但后来丢失。

小肠和结肠类器官

小肠上皮细胞的周转时间极短，约为5天。活跃增殖的Lgr5+肠干细胞位于隐窝基部。它们快速分裂、转运扩增（TA）的子细胞占据了隐窝的其余部分，并在分化后移动到绒毛的侧翼，最终在绒毛尖端死亡[6]。隐窝干细胞受四种信号通路的严格控制。Wnt构成维持干细胞命运和驱动干细胞和TA细胞增殖的关键通路。Notch有助于维持增殖性干细胞和TA细胞的未分化状态：当 Notch 信号被阻断时，细胞会立即分化为杯状细胞。表皮生长因子 (EGF) 信号对干细胞和TA 细胞产生强烈的促有丝分裂作用。最后，BMP信号在绒毛室中活跃，它们的抑制对于创造隐窝许可环境至关重要[7]。

将整个隐窝或单个Lgr5+干细胞悬浮在Matrigel中，并在添加了三种重组蛋白的无血清培养基中培养：R-spondin-1（Lgr5的Wnt信号放大器和配体）、EGF和Noggin（BMP抑制剂）。对于结肠隐窝培养，还需要Wnt3a使肠类器官看似无限期地生长，因为结肠上皮细胞本身几乎不产生Wnt。类器官严格地由一个简单的高度极化的上皮组成，紧密地闭合中央腔。地窖样结构向外突出。细胞的基底侧朝向周围的Matrigel。肠上皮细胞刷状边界形成管腔表面，而帕内特细胞和杯状细胞的分泌物则向管腔方向分泌，所有类型的上皮细胞均以正常比率呈现[8，9]。长期培养人类小肠和结肠类器官需要添加烟酰胺以及一种小分子ALK抑制剂和一种p38抑制剂。鉴于Lgr5蛋白表达极低，已经探索了其他干细胞标记物来启动肠道类器官培养，包括CD24，EphB2和CD166+/GRP78-。

总之，肠培养系统已经适应于产生代表一系列小鼠和人体组织的外胚层、中胚层和内胚层来源的上皮隔室的类器官。基本成分是：一、一种有效的Wnt来源；二、一种有效的酪氨酸激酶受体信号激活剂，如EGF；三、抑制BMP/Tgfβ信号，以及 四、Matrigel。

前列腺类器官

假复层前列腺上皮由基底细胞和管腔细胞组成。单个人类管腔细胞和基底细胞产生了类器官，但管腔细胞衍生的类器官更类似于前列腺。用R-spondin/Wnt刺激对于类器官的持续生长不是必需的，但会强烈诱导管腔细胞，从而导致类器官的前列腺样假复层结构。长期培养的类器官具有遗传稳定性，并在重组试验中重建前列腺[10]。Shen及其同事独立开发了一种基于Matrigel/EGF并补充了雄激素的培养系统，并报告了非常相似的观察结果[11]。

五、 类器官的应用

得益于其广泛的组织类型、长期扩展能力和生理3D结构，类器官正在成为许多生物医学研究中的主流细胞培养工具之一，也成为了许多生物学和临床应用的强大新技术。

目前，类器官已广泛用于包括发育生物学、疾病建模、精准医学、再生医学、毒理学、药物发现研究、宿主-微生物组相互作用、基因编辑、多组学和系统发育研究等方向。

类器官的多种应用方向（PMID: 32459504）六、类器官技术的挑战与展望

尽管3D类器官领域正在向前发展，并为生物医学研究和临床转化研究提供了创新方法，但仍有几个障碍需要解决。

类器官技术的挑战与展望

首先，人类类器官培养依赖于小鼠衍生的ECM替代品，如基质胶和基底膜提取物。由于批量生产，这些提取物显示出组分的可变性，这影响了生物研究中实验结果的可复制性。此外，由于其未知的病原体及其引发的潜在免疫反应，它们可能阻碍直接临床移植。这一缺点可以通过临床级胶原培养来解决。生物工程策略也将为改进方法提供新的方向。

限制当前类器官培养方法在未来再生医学应用中使用的另一个因素是这些方法无法模拟多器官病理。共培养方法可以部分解决这一问题。据报道，最近的一项相关尝试涉及hPSC衍生的肠道类器官和神经嵴细胞的组合。此外，最近的研究还设计了创建器官芯片技术的策略，以生成3D系统，实现多个预制“器官”之间的连接和通信。

组织成熟是限制类器官技术充分发挥临床前甚至临床应用潜力的第三个关键因素。例如，类器官培养系统在很大程度上复制了胎儿大脑发育阶段，这使得难以对影响成人大脑的神经系统疾病进行建模，例如阿尔茨海默病。为了克服这些障碍，已经优化了许多方案，包括用小分子化合物（如BDNF261）预处理类器官，以加速成熟。氧合和营养扩散是成熟过程中的另外两个关键因素。类器官的长期培养不会随着时间的推移而扩大，而是由于缺氧导致类器官的核心立即发生凋亡/坏死，形成空腔。这在大脑类器官培养系统中相对频繁地观察到。为了解决这个问题，类器官最初是在旋转生物反应器中或使用摇床生长的。其他的尝试是设计各种的血管化技术策略。例如，全脑类器官已重新嵌入含有iPSC衍生内皮细胞的基质凝胶中，以形成血管化的类器官，这进一步促进类器官的生长并提供营养；此外，生物材料、纳米技术、生物工程和其他先进方案的结合可能会使人类类器官在未来得以扩大和长期培养。

另一个令人困惑的问题是，有限的再现性是产生更高级别类器官和控制其功能的主要障碍。影响类器官再现性的基本因素基本上包括批间变异、类器官生产可扩展性、细胞组成和类器官结构。Krefft及其团队已经建立了一种前脑类器官方法，该方法通过基于iPSC的自组织能力添加模式因子来减少异质性。为了应对这些挑战，可以预见的是，一个相对准确、可复制的3D模型可能会出现，实现类器官技术从科学研究到临床实践的转变，并加速更大规模的类器官制造用于药物筛选。

值得注意的是，与PSC衍生类器官不同，AdSC衍生类器官仅代表器官的上皮部分，因此总结了原始上皮的典型结构和功能；相比之下，基质、神经、免疫细胞和脉管系统的隔室是缺失的。因此，ASC衍生的类器官显示出比PSC衍生的器官更低的结构复杂性，但更接近成人组织。

总体而言，新兴的类器官技术已经对生物医学研究、个体化医学中的药物筛选以及与基因组编辑技术相结合的基因治疗有用。类器官的广泛应用尚处于探索的初期阶段。广泛的研究将使3D类器官系统能够补充现有的模型系统，这将在未来加强基础和临床研究。

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